X染色體性連鎖視網膜分裂症是因為RS1基因缺陷，導致早發先天性黃斑部病變和嚴重視力喪失。然而，如何使用安全的基因組編輯技術來有效、精確地修復XLRS的基因仍然模糊不清。CRISPR/Cas9是一種高效，精確且經濟高效的基因組編輯技術，為多種人類疾病提供潛在的治療方案。基於CRISPR的技術，開發了利用NHEJ途徑的同源性獨立靶向整合（HITI）技術且能高效率地進行活體基因敲入。當前CRISPR技術主要採用病毒載體運輸，然而，病毒載體受限於乘載空間不足和安全性的考量，因此，非病毒傳遞方法有其必要性。本計畫將探索基於CRISPR的HITI基因編輯材料包裹到超分子納米顆粒（SMNP），然後通過SMNP傳遞方法，將其傳遞到特定細胞及XLRS病患誘導多能幹細胞衍生3D視網膜類器官和小鼠視網膜中進行基因敲入，達到表達RS1的可能性。因此，本研究的目標如下：1）採用小規模組合篩選獲得Cas9/sgRNA-質體ÌSMNPs和Donor DNAÌSMNPs最佳遞送效率的配方，2）測試是否可利用自我組裝的奈米載體將Cas9 / sgRNA質體和Donor-RS1/GFP質體共同遞送到細胞中來實現RS1基因敲入，3）探索使用SMNPs策略在老鼠眼睛進行RS1基因敲入，建立基因替代療法，4）通過SMNPs技術將基因敲入XLRS-hiPSCs衍生的3D視網膜類器官。本計畫將有助於開發新型基因治療技術，特別是患有遺傳性眼睛疾病的患者提供新一代的治療方法。

奈米鑽石（NDs）被認為是用於DNA，蛋白質和藥物傳輸的相對安全的碳奈米材料。尚未明確研究利用奈米鑽石提供CRISPR-Cas9系統進行基因編輯的可行性。因此，在這項研究中，我們使用奈米鑽石作為CRISPR-Cas9組件的載體，引入與XLRS相關的RS1基因突變。通過表面的羧化作用將直徑3 奈米的奈米鑽石顆粒官能化，並使其與mCherry螢光蛋白共價結合：一個編碼的Cas9核酸內切酶和GFP螢光蛋白基因，另一個編碼的sgRNA，並包含設計為引入RS1 c.625C> T突變的HDR模板插入物。奈米鑽石的傳遞導致在人iPSC和小鼠視網膜中引入RS1 c.625C>T突變。導致小鼠視網膜中的RS1表型XLRS的病理特徵，例如異常的感光細胞結構。
因此，建立SMNPs與奈米鑽石遞送平台之基因編輯技術，有助於開發新型基因治療技術於遺傳性疾病的治療。

奈米鑽石可以被iPSC和小鼠視網膜內化，引入RS1基因特異性突變修正。奈米鑽石與BSA的混合顯著增加了細胞的攝取。我們證明了CRISPR-Cas9攜載之奈米鑽石可治療小鼠視網膜的感光細胞缺陷，這是XLRS典型病徵。因此，我們建立的奈米鑽石基因修正平台在治療XLRS體內和體外疾病模型方面具有巨大潛力。

我們開發的基因治療技術是有效的、具有高度的生物安全性，可以大量標準化生產。 非病毒性的基因治療載體有其必要性，符合臨床需求的趨勢，帶來基因療法上突破性的影響。進一步將開發用於遺傳性疾病的有效治療藥物，人類誘導型多能幹細胞(iPSC)將用作各種疾病的測試平台。此外，將展開合作以增強基因編輯療法的技術。